Объектом исследования

служил полученный за счет мутагенеза нитрозогуанидином лейцинзависимый грам-положительный штамм RuMP факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, продуцент фенилаланина [10]. Потребость штамма в лейцине составляет 10 мг/л. Родительский штамм был получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского центра генетики и селекции промышленных микроорганизмов ГНИИГЕНЕТИКА.

Для приготовления ростовых сред

и адаптации штамма использовали 2H2O (99.9 ат.% 2H) и [U- 2Н] MetOH (97.5 ат.% 2H), полученные из Российского научно-исследовательского центра ИЗОТОП (Санкт-Петербург, РФ). Для создания высокого градиента концентрации 2Н2О в ростовых средах использовали 2Н2О с атомным содержанием дейтерия 99.9%. Фосфатсодержащие соли были дважды перекристаллизованы в абсолютной 2Н2О перед их использованием и высушены в вакууме. Тем не менее, процент дейтерированности ростовых сред после стериллизации влажным паром, измеренный методом ЯМР был ниже на 8-10% изотопной чистоты исходной 2Н2О). По необходимости 2H2O очищали от вредных примесей, перегоняя её над перманганатом калия [11].

Выращивание штамма

проводили в минеральной среде M9 [12], приготовленой на основе различных концентраций 2Н2О (см. таблицу) с добавками протонированного лейцина и [U-2H] MetOH при 370 С в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с наполнением средой до 50 мл в условиях интенсивной аэрации по методике [13]. После 6-7 суток роста клетки отделяли центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин). В культуральной жидкости анализировали секретируемые аминокислоты.

Адаптацию штамма

к 2Н2О проводили на агаризованных средах М9 (2%-ный агар), содержащих ступенчато возрастающий градиент 2Н2О (от 0 вплоть до 98 об.% 2Н2О). При этом использовали последовательный рассев штамма до отдельных колоний и последующую селекцию колоний, выросших на средах со ступенчатом градиентом 2Н2О. Отобранный штамм хранили в 50%-ном растворе (в 2Н2О) глицерина при -140С.

Морфологию клеток

исследовали с помощью интерференционно-поляризационного микроскопа МБР-5 (Венгрия).

Бактериальный рост

оценивали по величине оптической плотности суспензии клеток, измеренной на спектрофотометре Beckman-DU6 (США) при 540 нм в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм.

Тонкослойную хроматографию

(ТСХ) аминокислот проводили на пластинках Silufol UV-254 (Чехо-Словакия) в системе растворителей: изо-PrOH-аммиак, (7:3).

Секретируемый фенилаланин

определяли на приборе Beckman DU-6 (США) при 540 нм в образцах культуральной жидкости, объёмом 10 мкл после ее обработки 0.1% раствором нингидрина в ацетоне.

Уровни включения дейтерия в молекулы аминокислот

определяли методом масс-спектрометрии EI MS в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот на приборе MB-80A (Hitachi, Япония) при ионизирующем напряжении 70эВ, используя прямую дериватизацию лиофилизированных культуральных жидкостей дансилхлоридом и диазометаном [14].