В настоящей работе уровни включения дейтерия в молекулы аминокислот определяли методом масс-спектрометрии EI MS в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот, за счет сопоставления молекулярных масс протонированных и 2Н-меченых производных аминокислот.

Полученные микробиологическим синтезом 2Н-меченые аминокислоты представляли собой смеси изотопнозамещённых форм молекул, различающихся количеством атомов водорода, замещённых на дейтерий. Вследствие этого эффекта пики молекулярных ионов метиловых эфиров N-Dns-аминокислот в масс-спектрах были полиморфно расщеплены на кластеры за счет примеси молекул с отношениями m/z, больше или меньше детектируемых прибором величин (М)+ с различным вкладом в суммарный уровень дейтерированности. В качестве примера на рис. 4, б приведен масс-спектр смеси метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот полученных со среды с 98 об.% 2Н2О (масс-спектр приведен относительно контрольных условий (а) на обычной воде). Подсчет уровня дейтерированности молекул аминокислот проводили по величине самого интенсивного пика молекулярного иона (М)+, зарегистрированного самим масс-спектрометром; для фенилаланина - шесть (М+ при m/z 418 вместо М+ при m/z 412 для протонированного метилового эфира N-Dns-фенилаланина), для аланина -3.1 (М+ при m/z 339.5 вместо М+ при m/z 336.4), для валина -4.7 (М+ при m/z 369.2 вместо М+ при m/z 364.5), для лейцина/изолейцина -5.1 атома дейтерия (М+ при m/z 383.6 вместо М+ при m/z 378.5). Таким образом, общее количество дейтерия в молекуле фенилаланина составило 75%, аланине -77.5%, валине -58.8%, лейцине/изолейцине 51%. Уровни дейтерированности 2Н-меченых аминокислот семейства лейцина должны быть ниже остальных вследствие того что лейцин добавляли в ростовую среду в протонированном виде, что подтвердилось экспериментальными данными (см. выше). В то же время биосинтез фенилаланина был косвенно связан с ауксотрофностью по лейцину, поэтому дейтеривая метка в молекуле самого фенилаланина также была несколько разбавлена.

Полученные данные в целом подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация к 2H2О является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные клетки возвращались к нормальному росту и биосинтезу фенилаланина в протонированных средах после некоторого лаг-периода. В то же время эффект обратимости роста на 2H2O/Н2O- средах теоретически не исключает возможности того, что этот признак стабильно сохраняется при росте в Н2О, но маскируется при переносе клеток на дейтерированную среду. В общих чертах, при переносе клетки в дейтерированную среду она не только постепенно теряет обычную воду за счет насыщения внутриклеточной среды 2H2О, но и происходит очень быстрый изотопный (1Н-2H)-обмен в гидроксильных, карбоксильных, сульфгидрильных и аминогруппах всех биологических макромолекул, включая нуклеиновые кислоты и полипептиды. Затем в процессе роста клетки дейтерий включается в углеродные скелеты макромолекул, образуя связи типа С-2H [17]. В связи с тем, что физико-химические параметры С-2Н связи существенно отличаются от ее протонированного прототипа [18], можно предположить, что клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые способствуют стабилизации работы макромолекулярных компонентов жизненно-важных систем, которые подверглись дейтерированию. Не исключено, что положительные эффекты, наблюдаемые при адаптации к 2H2О связаны с образованием в 2H2O конформаций 2Н-меченых макромолекул с иными структурно-динамическими свойствами, чем конформаций, образованных с участием водорода, и поэтому имеющих другую активность и биологические свойства, подходящие для работы в 2Н2О. С другой точки зрения пространственная структура 2Н-меченых макромолекул может стабилизироваться в 2H2О за счет вторичного изотопного эффекта дейтерия и действия 2H2О как растворителя (большая структурированность, плотность и вязкость по сравнению с Н2О) [19].