Бактериальные штаммы

. Исследования проводили с генетически маркированными штаммами метилотрофных бактерий, полученными из коллекции культур Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов:

1. - Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцинзависимый штамм факультативных метилотрофных бактерий, продуцент L-фенилаланина.

2. - Methylobacillus flagellatum KT, изолейцинзависимый штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцент L-лейцина.

В работе

использовали 2Н2O (99,9% 2Н), С2Н3О2Н (97,5 % 2Н) и 13СН3ОН (97,5 % 13С), полученные из Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ), а также N-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид) (Sigma, CША), карбобензоксихлорид (Войковский химзавод, РФ).

Условия адаптации.

Адаптацию штаммов к дейтерию проводили на агаризованных средах (2 %-ный агар), содержащих тяжёлую воду. При этом использовали рассев культур до отдельных колоний на средах, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды [9].

Культивирование бактерий проводили на минеральной среде М9 [11], как описано в работе [9].

Гидролиз белка проводили с использованием 6 н. 2 НСl (в 2Н2О) и 4 н. Ва(ОН)2 (1100, 24 ч) [12].

Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ-метанол (2:1) по методу Блайя и Дайера [13].

Метиловые эфиры дансиламинокислот получали как описано в работе [8].

Бензилоксикарбонильные производные аминокислот получали как указано в работе [14].

Аналитическое и препаративное разделение бензилоксикарбонильных производных аминокислот культуральной жидкости и белковых гидролизатов проводили методом обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по раннее разработанной методике [15].

Разделение метиловых эфиров дансил-аминокислот проводили методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе “Knauer” (ФРГ), снабженным насосом “Knauer”, УФ-детектором “2563” и интегратором “С-R 3A” (Shimadzy, Япония). Использовали неподвижную фазу: Separon SGX C 18, 7 мкм, 150 x 3,3 мм (Kova, Чехословакия). Элюирование проводили в системе растворителей: (А) - ацетонитрил-трифторуксусная кислота (20:80 об/об) и (В) - ацетонитрил. Использовали градиентное элюирование: от 20% В до 100%В в течение 30 мин, при 100% В в течение 5 мин, от 100% В до 20% В в течение 2 мин, при 20% В в течение 10 мин.

Ионнообменную хроматографию белковых гидролизатов проводили на приборе “Biotronic LC 5001” (ФРГ), 230 x 3,2 мм, рабочее давление 50-60 атм, скорость подачи цитратного буфера 18,5 мл/ч, нингидрина 9,25 мл/ч, детекция при 570 и 440 нм.

Количественное определение L-фенилаланина в культуральной жидкости проводили на приборе “Beckman DU- 6” (США) при 540 нм, после обработки препаратов культуральной жидкости нингидрином.

Масс-спектры электронного удара производных аминокислот получены на приборе “MB-80A” (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ.

Р

езультаты и обсуждение.