Эффективность использования дансильных и Z-производных аминокислот для масс-спектрометрических исследований была показана раннее [10, 16]. В данной работе уровни включения изотопов 2Н-и 13С в мультикомпонентные смеси аминокислот в составе культуральной жидкости и белковых гидролизатов определяли методом масс-спектрометрии электронного удара метиловых эфиров дансил-аминокислот или в виде Z-производных аминокислот после их препаративного разделения методом обращённо-фазовой ВЭЖХ.

Производные аминокислот получали прямой обработкой препаратов культуральной жидкости и гидролизатов суммарных белков биомассы карбобензоксихлоридом (ZCl) или дансилхлоридом (DnsCl) и диазометаном (CH2N2). Реакцию проводили в щелочной среде в водно-органическом растворителе в соотношении карбобензоксихлорид (дансилхлорид)-аминокислота, равным 2:1 (схема 1).

Для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина наряду с монопроизводными было характерно образование ди-Z-(Dns)-производных: ди-Z,(Dns)-лизина, ди-Z,(Dns)-гистидина, О,N-ди-Z,(Dns)-тирозина, O,N-ди-Z,(Dns)-серина, O,N-ди-Z,(Dns)-треонина и N,S-ди-Z,(Dns)-цистеина (на схеме 1 эти произодные не показаны). Кроме этого, из аргинина синтезировался три-Z,(Dns)-аргинин.

Летучесть дансилпроизводных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе повышали за счет дополнительной дериватизации по карбоксильной группе (этерификации) диазометаном. Выбор диазометана как этерифицирующего реагента был обусловлен необходимостью проведения реакции в мягких условиях, исключающих изотопный (1Н-2Н) обмен в ароматических аминокислотах.

Данные масс-спектрометрии по уровням включения стабильных изотопов 2Н-и13С в бензилоксикарбонильные производные аминокислот в пределах одинаковых концентраций тяжёлой воды в среде не отличались от таковых, полученных для метиловых эфиров дансиламинокислот (точность определения уровней изотопного включения в аминокислоты данным методом составляет +5). Данные по уровням включения 2Н-и 13С секретируемые аминокислоты исследуемых штаммов приведены в таблице 3. Для введения дейтерия в аминокислоты B. methylicum использовали минимальные среды с 2 об.% СН3ОН и различным содержанием 2Н2О в них, поскольку раннее было показано, что вклад С2Н3О2Н в уровни дейтерированности аминокислот незначителен [10].

13С-аминокислоты были получены за счёт культивирования штамма M. flagellatum на среде, содержащей обычную воду и 1 об.% к 13CH3OH. Во всех анализируемых образцах культуральной жидкости не зависимо от рода штамма присутствовали аланин, валин, лейцин (изолейцин) и фенилаланин (см. табл. 3). В культуральной жидкости M. flagellatum в дополнение вышеназванным аминокислотам также накапливался глицин.

Таблица 3.

Уровни включения 2Н и 13С в секретируемые аминокислоты B. methylicum и M. flagellatum (данные получены для Z-,и Dns-производных аминокислот)*.