Иммобилизованный в ПЭ микрокапсулы, ХТР практически полностью сохраняет свою активность (86±9% по сравнению с нативным ферментом).Данные, полученные в результате сравнения гидролиза субстрата нативным ХТР и ХТР, включенным в ПЭ микрокапсулы, представлены в виде графика на рисунке 3. Изменение оптической плотности во времени обусловлено накоплением продукта ферментативного гидролиза. Полученные данные позволяют сделать следующие выводы: а) в процессе гидролиза отсутствуют стерические затруднения при диффузии субстрата через оболочку к молекулам иммобилизованного ХТР; б) равномерное распределение фермента в частицах при адсорбции, способствует практически полному гидролизу субстрата молекулами ХТР; в) при иммобилизации не происходит изменения конформации активного центра молекул фермента.

Комлексообразование ферментов с ПЭ приводит к снижению активность или не оказывает влияния, которое зависит от природы реагирующих веществ и условий. Так, авторы работы [16] по иммобилизации лактатдегидрогеназы в сетку ПЭ комплекса, отмечают семикратное падение активности иммобилизованного фермента. В нашем случае, включение белков в ПЭ микрокапсулы, способствует сохранению их активности и получению стабильных при хранении препаратов.

С целью изучения проницаемости оболочек к действию протеолитических ферментов было исследовано влияние растворов ТР на ПЭ микрокапсулы. Как известно, ТР входит в состав секрета поджелудочной железы и является эндопептидазой, т.е. он расщепляет пептидные связи, образованные основными аминокислотами, такими, как лизин [24]. Были использованы следующие концентрации ТР: 0,05%, 0,1% и 0,2%. Результаты показали, что микрокапсулы растворились в течение часа (оптическая микроскопия). С целью доказательства сохранения активности ХТР, после биодеградации микрокапсул был проведен гидролиз субстрата полученными растворами. Спектрофотометрическое изучение показало, что ХТР сохранил активность после разрушения ТР. Результаты этого исследования представлены на рисунке 4. Прирост оптической плотности, обусловленный накоплением продукта ферментативного гидролиза, свидетельствует о сохранении активности ХТР после разрушения ПЭ микрокапсул.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные эксперименты позволяют сделать вывод, что в качестве исходной матрицы для получения ПЭ микрокапсул, содержащих ХТР, наиболее приемлемыми являются CaCO3 микрочастицы. Использование последних позволяет проводить процесс микрокапсулирования в физиологически оптимальных значениях рН на всех этапах. Это открывает большие возможности для иммобилизации широкого спектра белков с сохранением их активности. Кроме того, при растворении твердой CaCO3 матрицы, микросферы сохраняют размер и форму, что свидетельствует об их существенной прочности, в том числе по отношению к осмотическому давлению. Полученные микрочастицы с узким распределением по размерам (3-5 мкм) имеют пористую структуру, что позволяет иммобилизовать на их основе различные белки методоми физической сорбции. Высокое содержание по белку (80% в случае исходной концентрации ХТР 5 мг/мл), а также биосовместимость и биодеградация полученных ПЭ микросфер, позволяют использовать их в качестве систем доставки включенного препарата.